魚類的熱耐受能力受多種因素的影響,如饑餓、運(yùn)動(dòng)、個(gè)體大小及馴化溫度等, 常以臨界高溫(The critical thermal maximum, CTmax)、臨界低溫(Critical thermal thermal minimum, CTmin)、致死高溫(Lethal thermal maximum, LTmax)和致死低溫(Lethal thermal minimum, LTmin)來評(píng)價(jià)。魚類通過游泳運(yùn)動(dòng)完成覓食和逃避敵害等重要日常生命活動(dòng)。魚類的游泳運(yùn)動(dòng)根據(jù)對(duì)氧氣的需求與否可分為有氧和無氧兩種類型, 其中無氧運(yùn)動(dòng)與避敵、穿越激流和穿梭復(fù)雜生境能力關(guān)系密切, 而最大勻加速游泳速度(Ucat)是評(píng)價(jià)魚類無氧運(yùn)動(dòng)能力的重要指標(biāo)。焦慮是動(dòng)物面對(duì)競爭、敵害或潛在威脅時(shí)最典型、最重要的應(yīng)激反應(yīng)之一。研究顯示, 焦慮對(duì)動(dòng)物生理和行為有雙重影響, 急性應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮是一種適應(yīng)反應(yīng), 有積極的作用, 如提高警覺性和注意力以應(yīng)對(duì)不利威脅, 但長期或嚴(yán)重的應(yīng)激暴露導(dǎo)致的焦慮可能影響動(dòng)物正常的生理和行為活動(dòng)。

實(shí)驗(yàn)材料為雌性成年(4-6月齡)斑馬魚,養(yǎng)殖在實(shí)驗(yàn)室斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(長45 cm×寬35 cm×高30 cm)中。光周期14L:10D,水溫為(28±0.5)℃, 溶氧量>7 mg/L。每日09:00和17:00按約2%體重/次的喂食量分別喂食豐年蟲和顆粒飼料1次, 投喂前關(guān)閉水閥和充氣泵, 投喂1h后用虹吸管清除水中殘余飼料和糞便, 以保持水體清潔。

分組及暴露方式：

挑選60尾體型大小相近的實(shí)驗(yàn)魚[體重(0.57±0.16) g, 體長(2.89±0.16) cm]隨機(jī)分為2組: 焦慮組(Anxiety group)和對(duì)照組(Control group), 每組30尾。焦慮組進(jìn)行2周UCS處理建立焦慮動(dòng)物模型,對(duì)照組保持原有條件飼養(yǎng)。期間, 焦慮組除UCS處理外, 其余飼養(yǎng)條件與對(duì)照組相同。在處理結(jié)束后禁食24h進(jìn)行焦慮行為、熱耐受能力和游泳能力測試。

實(shí)驗(yàn)方法：

焦慮行為評(píng)價(jià)

通過新缸潛水實(shí)驗(yàn)(Noveltank diving test)評(píng)價(jià)斑馬魚的焦慮行為。測定裝置為矩形水缸(長29 cm×寬10 cm×高15 cm), 對(duì)實(shí)驗(yàn)魚而言為陌生環(huán)境。裝水至水深10 cm, 分為上下兩個(gè)區(qū)域(分別高5 cm), 在水缸正前方50 cm處安置一個(gè)連接電腦的高清廣角攝像頭(Logitech WebcamPro9000, 1080×720 p), 將實(shí)驗(yàn)斑馬魚由循環(huán)養(yǎng)殖系統(tǒng)轉(zhuǎn)移至行為拍攝室, 適應(yīng)5min后再放入新水缸測試, 測試時(shí)長6min, 測試過程中拍攝視頻記錄斑馬魚的行為軌跡。利用人工觀察視頻分析斑馬魚6min內(nèi): (1)上下層穿梭次數(shù)(Transitions in upper half);(2)進(jìn)入頂層潛伏時(shí)間(Latency to upper half); (3)頂層停留時(shí)間占比(Proportion of time in upper half);(4)凍結(jié)潛伏時(shí)間(Latency before Freezing, 凍結(jié)指實(shí)驗(yàn)魚在2s或更長的時(shí)間保持不動(dòng)); (5)凍結(jié)次數(shù)(Freezing bouts); (6)凍結(jié)持續(xù)時(shí)間占比(Proportion of freezing time); (7)不穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)次數(shù)(Erratic movements,不穩(wěn)定運(yùn)動(dòng)指方向或速度的突然變化和快速的游泳行為), 以評(píng)價(jià)各組實(shí)驗(yàn)魚的焦慮行為。

熱耐受能力測定

焦慮行為測試結(jié)束后每組隨機(jī)選擇16尾魚(高溫耐受和低溫耐受各8尾)采用臨界溫度法測定熱耐受能力。測定裝置為50 L容器, 內(nèi)置4個(gè)單元格(細(xì)鐵絲網(wǎng)圍制, 長11.5 cm×寬9.5 cm×高15 cm), 每次可測定4尾魚。裝置內(nèi)水溫28℃, 溶氧>7 mg/L, 升溫/降溫前將斑馬魚分別放入單元格中適應(yīng)1h。適應(yīng)結(jié)束后通過冷水機(jī)(1.5 P)或可調(diào)功率加熱棒(3000 W)以0.3℃/min的速率進(jìn)行勻速降溫或升溫, 期間通過充氣泵持續(xù)充氣, 保證實(shí)驗(yàn)水體內(nèi)氧含量充足。使用精密溫度計(jì)監(jiān)控水溫變化, 以實(shí)驗(yàn)魚第一次失去平衡時(shí)的溫度作為CTmax或CTmin; 鰓蓋停止呼吸10s并對(duì)尾部刺激無反應(yīng)時(shí)的溫度為LTmax或LTmin。

游泳能力測定

使用Blazka式魚類游泳測定儀測定Ucat, 每組10尾魚。將單尾實(shí)驗(yàn)魚轉(zhuǎn)入儀器中適應(yīng)1h, 儀器中水流速度約為3 cm/s (約1倍實(shí)驗(yàn)魚體長/s)。隨后,將儀器中的水流速度以 0.167 cm /s2的恒定加速度持續(xù)增加, 直至實(shí)驗(yàn)魚無法向前游泳, 并停留在儀器末端時(shí)停止實(shí)驗(yàn), 此時(shí)的流速即為魚的 Ucat值。

斑馬魚慢性不可預(yù)測應(yīng)激處理方案

焦慮對(duì)動(dòng)物的生存產(chǎn)生著雙重效應(yīng)。急性應(yīng)激誘導(dǎo)的焦慮被認(rèn)為是一種適應(yīng)性反應(yīng), 但長期或嚴(yán)重的應(yīng)激暴露可能會(huì)對(duì)動(dòng)物的正常生理和行為活動(dòng)產(chǎn)生不利影響。然而, 2周UCS暴露誘導(dǎo)的焦慮對(duì)實(shí)驗(yàn)魚的低溫耐受能力產(chǎn)生了不利影響, 說明其代表了一種長期或嚴(yán)重的應(yīng)激壓力, 提示研究者在探究長期應(yīng)激導(dǎo)致的焦慮對(duì)魚類生理和行為的影響時(shí)可以參考該模型。在自然界中, 游泳與魚類的覓食、避敵及棲息地選擇等日常生命活動(dòng)息息相關(guān), 因此游泳能力成為反映魚類生存適合度的重要指標(biāo)。長期應(yīng)激導(dǎo)致的焦慮可能會(huì)造成魚類能量代謝增加, 體質(zhì)以及免疫力下降, 進(jìn)而對(duì)游泳能力產(chǎn)生消極影響。

最大勻加速游泳速度(Ucat)比較

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