光學顯微鏡的分辨率受到衍射極限的限制，只能達到 ~ 200 nm 的分辨率。在最近二十年中，STED、SIM、PALM/STORM、DNA-PAINT 等一系列技術，通過點擴展函數(shù)（point spread function, PSF）的調制，突破了光學衍射的限制，使光學分辨率最低達到 20 nm，得到廣泛的生物應用并獲得 2014 年的諾貝爾化學獎。

那么分辨率到底有沒有極限？2017年，諾貝爾獎得主 Stefan Hell（STED 技術的發(fā)明人）又發(fā)展了 MINFLUX 技術（MINimal photon FLUXes, 最低光子數(shù)顯微成像），進一步提升了光學分辨率，可以獲得 ~ 1 nm 的定位精度和 ~ 5 nm 的空間分辨率。MINFLUX 作為單分子定位技術，結合了 STED 與 STORM 兩種技術的特點。與 STED 的淬滅光使用甜甜圈（donut）形狀的中空光斑不同的是，MINFLUX 使用 donut 光斑作為激發(fā)光；類似 GPS 定位的原理，MINFLUX 使用甜甜圈光斑對熒光分子進行多次成像，進而可以通過統(tǒng)計學方法，估計出熒光分子的位置。

空間分辨率可被認為與定位精度成正比關系。也就是說，通過提升定位精度，可以進一步提高空間分辨率。~ 1 nm 的定位精度，已經(jīng)與單個分子的大小十分接近；但空間分辨率并未達到分子大小，仍有提升的空間。是否有新的方法，可以進一步提升定位精度，從而提升空間分辨率呢？

北京大學的席鵬實驗室在理論上提出，如果將雙光子激發(fā)（two-photon excitation, TPE）用于 MINFLUX 技術中，可以再將定位精度和分辨率提高 2 倍，獲得小于 1  nm  的定位精度。

該結果以 Two-photon MINFLUX with doubled localization precision 為題，發(fā)表于 eLight。（論文網(wǎng)址：https://doi.org/10.1186/s43593-021-00011-x）

該文章認為，雙光子 MINFLUX（Two-photon MINFLUX, 2p-MINFLUX）不僅可以提升 2 倍的定位精度，同時可以具有更為直接的多色成像能力。

來自阿根廷生物科學研究中心的 Fernando D. Stefani 教授為本文撰寫了 News & Views，以 Multiphoton single-molecule localization by sequential excitation with light minima 為題發(fā)表于 Light: Science & Applications。（論文網(wǎng)址：https://doi.org/10.1038/s41377-022-00763-2）

MINFLUX 的技術原理關鍵在于，donut 光斑零點附近的梯度，遠高于高斯光（Gaussian beam）頂點附近的梯度。MINFLUX 使用 donut 零點附近進行定位，即可降低定位所需光子數(shù)量、提高定位精度。

文章認為，由于雙光子激發(fā)的非線性效應，熒光強度正比于激發(fā)光強度的平方，于是 donut 零點附近的梯度將被進一步提高（圖1）。對比 2p-MINFLUX 和傳統(tǒng) MINFLUX，在采集到同樣熒光光子數(shù)的條件下，2p-MINFLUX 理論上可以獲得 2 倍的定位精度提升；若為獲得同樣定位精度，2p-MINFLUX 只需要 1/4 的光子數(shù)即可實現(xiàn)。

圖1：單光子和雙光子 MINFLUX 的定位精度比較。梯度（斜率）變?yōu)樵瓉淼?2 倍，置信區(qū)間的寬度變?yōu)榱嗽嫉囊话耄淳忍嵘?2 倍

MINFLUX 的定位精度通過 C-R 下界（CRB, Cramér–Rao Bound）表示。文章通過數(shù)學推導，嚴格的證明了雙光子效應使 CRB 變?yōu)樵瓉淼?1/2，即定位精度提高了 2 倍，該提升對  xyz  三個維度均成立。

文章進一步分析了多種實驗參數(shù)對定位精度的影響，包括熒光光子數(shù)、偏置長度、信背比等。與現(xiàn)有 MINFLUX 技術（1p-MINFLUX）相同，在 2p-MINFLUX 中，信背比決定了偏置長度的最小值，最終限制了可獲得的定位精度。而實際上，雙光子技術的特性之一，即是降低焦點外的熒光背景。由于雙光子激發(fā)只發(fā)生在焦點，三維空間其他位置沒有激發(fā)，雙光子 MINFLUX 具有比單光子 MINFLUX 更低的背景，可能進一步提高定位精度。為了直接對比雙光子 MINFLUX 和現(xiàn)有 MINFLUX 技術的性能，在模擬中各參數(shù)的數(shù)值選取均保持一致。

文章模擬了 2p-MINFLUX 和現(xiàn)有 1p-MINFLUX 成像過程和結果，并進行對比（圖2）。一方面，在 2p-MINFLUX 和 1p-MINFLUX 采集到同樣熒光光子數(shù)的條件下，1p-MINFLUX 無法分辨的結構，可由 2p-MINFLUX 分辨（圖2b vs c）。另一方面，在 2p-MINFLUX 和 1p-MINFLUX 達到同樣定位精度時，2p-MINFLUX 只需要 1p-MINFLUX 的 1/4 的光子數(shù)（圖2b vs d）。

圖2：雙光子 MINFLUX 的模擬成像結果。該結果直觀體現(xiàn)了 2p-MINFLUX “定位精度 2 倍”和“光子數(shù) 1/4 倍”的關系

文章最后討論了實驗可行性。文章認為由于雙光子熒光速率（fluorescence rate）低于單光子熒光，2p-MINFLUX 的熒光速率預計是 1p-MINFLUX 的一半。同時，與 1p-MINFLUX 相對于共聚焦成像提高了激發(fā)光強相同，2p-MINFLUX 的激發(fā)光光強，相對于雙光子成像也預計需要提高 1 個數(shù)量級。此外實驗中也需要注意雙光子激發(fā)波長的選擇，其對光斑質量和多色能力均會存在影響。

總而言之，MINFLUX 技術的分辨率可以由雙光子非線性效應所提升，可以提升 2 倍的定位精度和分辨率，或者降低 4 倍的所需熒光光子數(shù)。熒光顯微鏡的分辨率可以進一步接近單個分子大小的極限。

作者最后展望，由于雙光子非線性效應的存在，2p-MINFLUX 將可能具有更為直接的多色成像能力；同時，2p-MINFLUX 不僅可以作為超分辨成像手段，也可作為高速多色單分子追蹤的方法。該技術可以進一步促進生物醫(yī)學領域的基礎研究，尤其是生物互作方面諸如核酸-蛋白互作、病毒-細胞互作的研究。

論文信息

Zhao, K., Xu, X., Ren, W. et al. Two-photon MINFLUX with doubled localization precision. eLight 2, 5 (2022).

https://doi.org/10.1186/s43593-021-00011-x

論文相關 | 新聞與觀點

Masullo, L.A., Stefani, F.D. Multiphoton single-molecule localization by sequential excitation with light minima. Light Sci Appl 11, 70 (2022).

https://doi.org/10.1038/s41377-022-00763-2

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