撰稿 | 楊暐健 （加州大學戴維斯分校 助理教授）

說明 | 本文由論文作者（課題組）撰稿

大腦是我們最重要也是最神奇的器官。隨著年齡的增大，人們患腦疾病的風險急劇增加。對大腦的深入認知不僅有助于研發(fā)治療腦疾病的藥物和方案，也可以啟發(fā)新的人工智能技術。作為研究大腦的重要工具之一，如何對大腦活動進行高精度記錄和調控成為近年來的研究熱點。

美國加州大學戴維斯分校的楊暐健博士致力于研制先進的光學顯微鏡技術，并對活體小鼠腦神經活動進行高精度的記錄和調控。他于2021年獲得美國科學雜志和北京品馳醫(yī)療公司聯(lián)合創(chuàng)辦的Science & PINS神經調控獎（獎項介紹>>>），以表彰他在雙光子三維全息光遺傳學的貢獻，并于2021年8月6日以唯一作者身份在《Science》發(fā)表了題為 Manipulating neuronal circuits, in concert 的文章。

圖源：《science》

經Light學術出版中心（關于我們>>>）邀請，本文，楊暐健博士將介紹他近期的工作進展，并重點介紹雙光子全息光遺傳學技術，以及它在神經科學的應用。

光遺傳學（名詞解釋>>>）是一種新興的神經活動調控技術。通過基因改造技術，研究者們可以在特定類型的神經細胞上表達對光敏感的離子通道（名詞解釋>>>）。當受到特定波長光照射的時候，這些離子通道可以被打開，從而激發(fā)或者抑制神經活動。

相比利用藥物對神經活動進行調控，光遺傳學具有優(yōu)異的時空特定性。而相比傳統(tǒng)的插入式電極刺激，光遺傳學能夠對特定類型的神經細胞進行非侵入式的刺激。基于這些優(yōu)點，光遺傳學備受神經科學研究者們的青睞，被廣泛應用于神經環(huán)路和腦疾病的研究中。

雖然對不同類型的細胞具有特異性，光遺傳學卻不一定能夠對屬于同一類型的細胞進行有選擇性的刺激。當使用藍光或綠光激發(fā)時，目標腦區(qū)中的很大一個三維區(qū)域都會被照射到，從而刺激到在該區(qū)域內所有屬于某一特定類型的神經細胞。

由于這些細胞可能具有不同的功能，如果它們被無差異地刺激，研究者們將很難對神經環(huán)路的響應進行研究。為了實現高精度調控，我們有必要把光精準地投射到由研究者設定的目標細胞上，而非一整個區(qū)域。根據不同的應用需求，目標細胞可以是單一細胞，也可以是分布在三維神經環(huán)路中的一群指定細胞。這種在三維空間中可編輯的激發(fā)方式是傳統(tǒng)顯微鏡無法實現的。

雙光子全息顯微鏡可以克服上述這一難關。這里涉及兩個技術。

第一，雙光子激發(fā)（名詞解釋>>>）。它具有光學切片（名詞解釋>>>）能力：由于雙光子的激發(fā)效率和光強的平方成正比，這使得雙光子激發(fā)效率在聚焦區(qū)域達到頂峰，而在聚焦區(qū)域之外迅速減弱。同時，雙光子激發(fā)使用近紅外光，在生物樣品中的光散射較弱，可以高質量地聚焦到樣品比較深的區(qū)域。

第二，光全息技術（名詞解釋>>>）。通過一個空間光調制器（名詞解釋>>>），光全息技術可以把激發(fā)光分解并聚焦到三維空間中的多個區(qū)域。把雙光子激發(fā)和光全息技術結合起來，就可以同時對分布在三維空間中的多個目標神經細胞進行刺激，而不直接影響到它們周圍的細胞。通過快速切換光全息圖，不同的目標細胞群可以依次被刺激到。所以雙光子全息顯微鏡同時具有很高的空間和時間分辨率。

圖：通過空間光調制器構建三維全息投射。[W. Yang, et. al, Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Current Opinion in Neurobiology 50, 211-221 (2018)]

圖：雙光子全息顯微鏡在熒光樣品中的三維投射例子。[W. Yang, et. al, Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018)]

楊暐健博士及其合作者是最早把雙光子全息光遺傳學應用到活體小鼠大腦中，實現對在三維空間中的一組神經細胞進行刺激，并同時記錄其活動的團隊之一。在此之前，雙光子全息光遺傳學僅僅被應用在小鼠大腦切片中，又或是活體小鼠大腦的單一切面中。

楊暐健博士將此技術推廣到三維大腦空間，他的雙光子顯微鏡有兩大特點：

1. 該顯微鏡擁有兩個光路，把雙光子三維高速鈣離子成像（名詞解釋>>>）和雙光子三維全息光遺傳學結合起來，實現對神經活動的同時讀寫。其中一個光路實現鈣離子成像，對神經活動進行記錄。另外一個光路實現全息光遺傳學，對神經活動進行調控。通過在鈣離子成像光路中設置一個電調焦透鏡，顯微鏡可以高速記錄在不同深度的神經細胞活動。通過這一神經活動圖，研究者們可以選定目標神經細胞，并把它們的空間位置編碼到空間光調制器中，從而在樣品中生成三維全息投射并刺激目標神經細胞。為了避免“讀”和“寫”的相互串擾，兩光路使用不同波長的光，可以獨立激發(fā)對應的鈣離子探針和光敏離子通道。

2. 該顯微鏡可以同時刺激多個神經細胞，但又要避免使用過高的激光能量而在大腦中產生過多熱量。為了實現這一目標，該顯微鏡使用低重復頻率的飛秒激光器作為光遺傳學的雙光子光源。相比在雙光子顯微鏡中普遍使用的高重復頻率飛秒激光器，低重復頻率飛秒激光器有很高的單脈沖能量，從而在保持低平均功率的情況下大大提高了雙光子激發(fā)效率。利用這一優(yōu)點，該顯微鏡可以用比較低的激光功率同時刺激近百個神經細胞。

圖：通過雙光路顯微鏡對小鼠大腦神經活動的高精度記錄和調控。[W. Yang, et. al, Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018)]

雙光子全息光遺傳學可以把信息精確地寫入大腦中，這為調控大腦活動和動物行為提供了一個有力工具。在2019年《Cell》的一篇論文中，楊暐健博士及其合作者證實了對小鼠視覺皮層神經細胞的精確調控可以模擬小鼠的視覺感知，并觸發(fā)其行為。換句話說，視覺信息無須通過眼睛進入大腦，而可以被雙光子全息光源直接寫入到大腦，使小鼠 “感知” 到真的視覺刺激。除此以外，雙光子全息光遺傳學還可以對大腦進行編程。多個實驗室證實，如果在激發(fā)一組大腦神經細胞的同時給予小鼠獎勵，那么小鼠可以學會把這組神經細胞的活動和獎勵聯(lián)系起來。這相當于人工建立了一個神經活動和動物行為的新鏈接。

正如楊暐健博士在其《Science》的獲獎論文中提及：雙光子全息顯微鏡把光遺傳學帶入到一個嶄新的精準時代。展望未來，雙光子全息光遺傳學將繼續(xù)在基礎神經科學中發(fā)揮重大作用，也有望在精準醫(yī)學中大展身手。

論文信息

Yang W, Carrillo-Reid L, Bando Y, Peterka DS, Yuste R. Simultaneous two-photon imaging and two-photon optogenetics of cortical circuits in three dimensions. eLife 7, e32671 (2018).

https://doi.org/10.7554/eLife.32671

Yang W, Yuste R. Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Current opinion in neurobiology 50, 211-221 (2018).

https://doi.org/10.1016/j.conb.2018.03.006

Carrillo-Reid L, Han S, Yang W, Akrouh A, Yuste R. Controlling visually guided behavior by holographic recalling of cortical ensembles. Cell 178, 447-457.e5 (2019).

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.05.045

Yang W, Manipulating neuronal circuits, in concert. Science 373, abj5260 (2021).

https://doi.org/10.1126/science.abj5260

編輯 | 趙陽

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